Jesse Eisenberg lahir di Queens, New York City, dari keluarga Yahudi yang memiliki tradisi intelektual dan artistik yang kuat. Ayahnya, Barry Eisenberg, bekerja di bidang kesehatan dan kemudian menjadi profesor di sebuah perguruan tinggi, sementara ibunya, Amy Fishman, adalah badut profesional yang bekerja di acara anak-anak dan juga mengajar di sekolah. Jesse tumbuh besar di East Brunswick, New Jersey, bersama dua saudara perempuannya, Sheryl dan Hallie Eisenberg. Hallie adalah aktris cilik terkenal pada akhir 1990-an, yang sering dijuluki sebagai “The Pepsi Girl.”

Sejak usia muda, Jesse menunjukkan minat besar dalam seni peran. Ia mulai menulis naskah teater sejak usia remaja, dan karya tulisnya menjadi outlet emosional dalam menghadapi tekanan sosial dan tantangan hidup. Eisenberg menderita gangguan kecemasan sosial dan merasa seni peran adalah cara untuk menyalurkan perasaannya serta mengatasi rasa cemasnya.

Eisenberg memulai karir aktingnya di dunia teater saat masih duduk di bangku SMA. Ia mendapat peran pertamanya di drama Broadway The Gathering pada tahun 1999. Kemudian, ia debut di layar kaca melalui serial televisi Get Real (1999-2000). Namun, nama Eisenberg mulai dikenal luas ketika ia tampil dalam film The Squid and the Whale (2005), yang mendapatkan pujian kritis dan memamerkan kemampuan aktingnya yang intens.

Namun, puncak kariernya datang ketika ia memerankan Mark Zuckerberg, pendiri Facebook, dalam film The Social Network (2010) garapan David Fincher. Penampilannya yang brilian sebagai Zuckerberg membuatnya mendapatkan nominasi Oscar untuk Aktor Terbaik. Ia berhasil menggambarkan kompleksitas emosional dan sisi manipulatif dari seorang pengusaha muda yang ambisius.

Selain itu, Eisenberg telah membintangi berbagai film populer lainnya, seperti Zombieland (2009), Now You See Me (2013), dan Batman v Superman: Dawn of Justice (2016), di mana ia memerankan Lex Luthor dengan sentuhan unik yang memecah pendapat kritikus.