Darah Nyai dibuka dengan tragedi mengerikan: seorang wanita muda bernama Lisa menjadi korban pemerkosaan dan pembunuhan brutal oleh kelompok sindikat perdagangan manusia. Jasadnya dibuang ke Laut Selatan, yang memicu kebangkitan entitas mistis Nyai Sumekar—sosok gaib penjaga pantai selatan—dengan amarah yang membakar.

Nyai memilih Rara (diperankan Violla Georgie) sebagai alat pembalasan. Melalui perantaraan kekuatan supranatural, Rara berubah menjadi sosok penuh dendam yang memburu para pelaku kejahatan—khususnya sindikat pimpinan Boni (Rory Asyari)—dengan serangkaian pembunuhan sadis dan simbolik di sepanjang pesisir Jawa Selatan.

Di sisi lain, Inspektur Yati (Vonny Anggraini) memimpin penyelidikan atas kejadian misterius tersebut. Ia bertemu dengan Mbak Endang (Djenar Maesa Ayu), perempuan spiritual yang memahami hubungan Nyai, Laut Selatan, dan kekuatan gaib yang menyelimuti tragedi ini. Pencarian terhadap dalang menyingkap lapisan mistik dan sosial yang lebih dalam.

Film ini memadukan horor mistis lokal, elemen slasher, dan kritik sosial terhadap isu femisida dan perdagangan manusia. Dengan estetika visual ala era 1980–90-an dan aura retro yang menggelitik nostalgia, Darah Nyai menciptakan pengalaman sinematik penuh identitas budaya dan ketegangan supernatural yang kuat.