David Harbour lahir di White Plains, New York, dan dibesarkan dalam keluarga yang sangat mendukung kecintaannya pada seni. Ayahnya bekerja di bidang real estat, sementara ibunya adalah seorang guru. Ia menempuh pendidikan di Dartmouth College, di mana ia mengeksplorasi minatnya pada seni peran melalui teater kampus. Setelah lulus, Harbour memulai karier aktingnya di Broadway sebelum beralih ke layar kaca dan layar lebar.
Ia menjadi terkenal berkat perannya sebagai Jim Hopper dalam serial Netflix Stranger Things, yang memberinya nominasi Emmy. Harbour juga mendapatkan pengakuan luas untuk perannya sebagai Alexei Shostakov alias Red Guardian dalam film Marvel Black Widow (2021), di mana ia memerankan karakter yang kompleks dengan perpaduan humor dan hati.